Explicado: Por que o teste de várias pessoas com sintomas de Covid é negativo?
Muitas pessoas com sintomas de Covid-19 apresentaram resultados negativos. Existem várias razões prováveis, como mutações na detecção de escape do vírus, qualidade da amostragem e teste e eficácia dos kits de RT-PCR.
Os testes podem dar errado em vários estágios, desde a coleta e armazenamento incorretos de amostras até a extração e amplificação incorretas. (Foto expressa: Vishal Srivastav) Enquanto a Índia luta para lidar com a demanda sem precedentes por testes RT-PCR, os relatórios sugerem que até 20% dos pacientes com Covid-19 sintomáticos apresentam resultados negativos.
Essa tendência aparente de resultados falsos negativos pode impedir a internação hospitalar de pacientes graves e os cuidados intensivos, ao mesmo tempo em que permite que os assintomáticos se movimentem e espalhem o vírus. A tendência levou especialistas, incluindo o diretor da AIIMS, Dr. Randeep Guleria, a recomendar o tratamento com Covid-19 para todos que apresentassem sintomas clássicos, independentemente dos resultados do RT-PCR.
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Por que falsos negativos
Os testes de RT-PCR, considerados o padrão ouro no diagnóstico de Covid-19, não pretendem ser perfeitos. A sensibilidade mínima (capacidade de detectar positivos) exigida pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR) para validar um teste de RT-PCR é de 95%. Isso significa que até 5% de resultados falsos negativos são esperados.
Embora relatórios anedóticos sugiram que a proporção de resultados falsos negativos está aumentando em toda a Índia, ainda não há nenhum estudo para comprovar isso.
Em teoria, quatro grandes fatores determinam a precisão de um teste de RT-PCR: a carga viral na pessoa, a qualidade da coleta e processamento da amostra, a eficácia do próprio kit de teste e também a referência para a interpretação do teste.
CARGA VIRAL: Normalmente, Covid-19 se manifesta adequadamente no quinto dia de um ciclo de infecção. Testado logo após a exposição, uma pessoa infectada pode apresentar Covid negativo. Este pode não ser um fator importante por trás da tendência recente de falso negativo, uma vez que certos mutantes de Covid-19 aparentemente apresentam sintomas iniciais.
Vários pacientes sintomáticos com teste falso negativo em ensaios RT-PCR foram posteriormente confirmados como Covid-positivo em testes de Lavagem Broncoalveolar (BAL) que coletam amostras do trato respiratório inferior por meio de um broncoscópio. Isso levou a conjecturas de que certos mutantes contornam o trato respiratório superior para atingir o pulmão - um cenário que pode negar um teste de RT-PCR, com base na amostra coletada da cavidade nasal e garganta, a carga viral necessária para um resultado preciso.
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EXPLOSÃO DE CAPACIDADE: O número de laboratórios de teste da Covid na Índia aumentou de 14 em fevereiro de 2020 para mais de 2.400 em abril de 2021. Essa rápida expansão exigiu a aprovação de centenas de laboratórios para testes RT-PCR e treinamento de milhares de técnicos rapidamente.
Como proteção, o ICMR em julho de 2020 listou 30 laboratórios de controle de qualidade para verificar todos os laboratórios da Covid que aprovou. Outros 8 laboratórios de controle de qualidade foram adicionados desde então. No entanto, fontes em vários laboratórios em três estados disseram que apenas algumas inspeções de instalações e instrumentos ocorreram.
Idealmente, uma mistura de amostras positivas e negativas deve ser coletada aleatoriamente em cada laboratório periodicamente para novo teste. Isso já foi feito? sim. Isso foi feito de forma consistente? Não, disse um cientista de um instituto do ICMR que não está autorizado a falar com a mídia.
Abordados para monitoramento laboratorial periódico e dados de conformidade de qualidade desde julho de 2020, o ICMR e vários laboratórios de controle de qualidade permaneceram em silêncio.
ELEMENTO HUMANO: Os testes podem dar errado em vários estágios - desde a coleta e armazenamento de amostras ruins até a extração e amplificação defeituosas. Todos os kits de RT-PCR incluem um controle interno (IC) para proteger contra um cenário em que nenhum RNA é extraído / amplificado, levando a um falso negativo. O IC pode ser exógeno ou endógeno. É exógeno quando uma molécula modelo de RNA artificial é adicionada a cada amostra antes da extração do RNA. O teste é considerado nulo quando o RNA sintético não é detectado após a extração e um novo teste é prescrito. E, um controle endógeno usa um gene humano de 'manutenção' presente na amostra; sua não detecção após o procedimento de extração de RNA invalida o teste.
Um gene humano de manutenção também garante a qualidade da amostra ... Mas mais de 75% dos kits de RT-PCR no mercado indiano usam os controles internos exógenos mais baratos, disse um biólogo molecular baseado em Mumbai.
O SOP de abril de 2020 do ICMR sobre RT-PCR considerou que o controle exógeno para extração pode ser ignorado, pois não refletirá a qualidade da amostra coletada. Recomendou RNase P separado ou qualquer outro gene de manutenção humana ... deve ser executado em paralelo em um tubo separado ... (para) verificar a qualidade da amostra coletada e o procedimento de extração.
Em maio de 2020, a mega licitação lançada pelo ICMR / HLL para kits de RT-PCR especificou requisitos semelhantes. Vários fabricantes argumentaram que diferentes empresas usam controles internos diferentes, incluindo controles exógenos, que foram aprovados por agências regulatórias como FDA e CEIVD, e que a seleção adversa baseada em genes domésticos desencorajaria a concorrência justa. Por fim, a licitação foi revisada para incluir opções endógenas e exógenas de controle interno.
MUTAÇÃO VIRAL: Um teste RTR-PCR tem como alvo áreas específicas de um ou mais genes virais para detectar sua presença. Um teste pode retornar resultados falsos negativos se ocorrer uma mutação no segmento do genoma avaliado. Testes que usam múltiplos alvos genéticos, como os que são usados na Índia, têm menos probabilidade de serem enganados por mutações.
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Reguladores como o FDA dos EUA monitoram rotineiramente o impacto das mutações nos testes RT-PCR Embora especialistas como o Dr. Rakesh Mishra, diretor do Centro de Biologia Celular e Molecular de Hyderabad (CCMB), sintam que o ICMR deve iniciar um exercício semelhante, pode não ser fácil de monitorar em tempo real mais de 200 kits RT-PCR aprovados na Índia contra mutações emergentes.
Por um lado, nenhum fabricante divulgou (ou tornará) públicas as sequências detalhadas que seus testes visam. Ao serem submetidos à validação do ICMR, eles mencionam apenas os genes-alvo e não a sequência do primer, disse um pesquisador sênior do Ministério da Saúde.
Até agora, porém, há motivos para se sentir bastante confiante, mesmo na ausência de qualquer verificação de eficácia em tempo real. Até agora, as variantes de Covid-19 apresentam principalmente mutações no gene S (proteína de pico). A maioria dos kits aqui usa regiões conservadas (inalteradas) de alvos, disse a Dra. Shanta Dutta, diretora do Instituto Nacional de Cólera e Doenças Entéricas (NICED), Calcutá.
Queda de preço
Em um ano, o preço do kit RT-PCR caiu de mais de Rs 1.100 para menos de Rs 40. Desde que a isenção de impostos de importação foi retirada em outubro de 2020, a maioria das marcas estrangeiras deixou o mercado indiano devido ao encargo de custo adicional de 15%. Várias marcas indianas também têm se recusado a vender abaixo de Rs 100. Muitos encontraram uma clientela corporativa dedicada que não se importa em pagar um pouco mais para garantir a qualidade. Alguns estão até oferecendo vários kits de PCR com preços diferentes.
Embora ninguém o diga oficialmente, muitos questionam a qualidade da concorrência mais barata. A contra-visão é que cada kit de teste disponível no mercado atende aos padrões de validação do ICMR e que qualquer guerra de preços, em última análise, beneficia o consumidor.
Porém, nem todo mundo está convencido. A queda correspondente no custo do teste de laboratório é de Rs 4.500 para Rs 800. Além disso, alguém que visita o laboratório local para um teste da Covid sabe qual kit está sendo usado? Quantos laboratórios gastarão Rs 100 quando puderem usar um kit Rs-40? disse um dos primeiros fabricantes indianos de kits PCR da Covid.
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O Valor Ct
Um teste de RT-PCR amplifica o ácido nucleico extraído da amostra para detectar aquele específico para o vírus Covid-19. A amplificação ocorre em ciclos com um valor limite (Ct). Claramente, quanto maior a presença / carga viral, menor o valor Ct ou o número de ciclos de amplificação necessários para torná-lo detectável.
O ICMR definiu o valor Ct em 35 para resultados negativos. Além disso, qualquer vestígio de vírus potencialmente presente é considerado insignificante e a amostra é considerada negativa para Covid.
Mas certos estados, como Maharashtra, procuraram esticar o limite de admissibilidade, sugerindo um valor Ct de 24. Como isso excluiria potencialmente um grande número de pessoas com carga viral quantitativamente mais baixa, mas clinicamente significativa, o ICMR reiterou sua posição sobre um valor Ct de 35 .
No entanto, há pouca clareza se todos os estados estão seguindo o mesmo benchmark Ct. De acordo com executivos seniores de pelo menos duas redes de laboratórios multiestaduais, eles receberam instruções verbais contraditórias e às vezes injustificadas sobre esses parâmetros de teste. Mesmo um teste molecular não é imune a tendências subjetivas.
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